Clémentine-Hélène Dufau (née Catherine-Hélène Dufau) naît dans une famille aisée du sud-ouest de la France. À son baptême, on lui donne le prénom de Clémentine-Hélène. Une fois artiste, c’est celui qu’elle choisit comme signature jusqu’en 1925, puis elle le simplifie en « Hélène Dufau ».
Une chute dans l’enfance la rend légèrement boiteuse et l’oblige à rester allongée de longs moments. La lecture et le dessin vont dès lors remplir sa vie. Les deux filles aînées mariées, la famille Dufau s’installe à Paris en 1888 pour que Clémentine-Hélène puisse suivre les cours de William Bouguereau (1825-1905) et de Tony Robert-Fleury (1837-1911) à l’académie Julian.
Elle expose pour la première fois au Salon des artistes français en 1889. Elle y est récompensée en 1895 par le prix Marie-Bashkirtseff, qui salue les jeunes talents. En 1897, une médaille de troisième classe au même salon la consacre comme artiste professionnelle : l’État lui achète Fils de mariniers. Marguerite Durand lui demande de faire l’affiche du quotidien féministe La Fronde qu’elle vient de créer, réalisation très remarquée. L’année suivante, C.-H. Dufau obtient une bourse de voyage et visite l’Espagne, la Belgique et les Pays-Bas. À partir de 1902, elle est hors concours au Salon des artistes français. Son tableau Automne (1902) est acheté pour le musée du Luxembourg. Dès 1903, elle participe aussi au Salon d’automne.

Sa carrière lancée, elle est suivie par la presse artistique mais aussi féministe et féminine, et est régulièrement citée dans les comptes rendus artistiques des quotidiens aux côtés des peintres masculins. Le critique Camille Mauclair lui dédie un article de douze pages en 1905. On salue son métier, ses qualités de coloriste. Parallèlement, elle réalise des affiches pour des marques comme Byrrh, des bals ou des expositions. Elle illustre des livres : Basile et Sophia (1900) de Paul Adam, Les Femmes de Setné (1903) de J.-H. Rosny…
Proche des symbolistes et des milieux ésotériques, plus ouverts aux femmes, C.-H. Dufau bénéficie de réseaux et de soutiens encore peu étudiés. L’État lui passe d’importantes commandes : en 1900, une série d’estampes morales pour les écoles et, surtout, en 1905, quatre panneaux décoratifs pour la salle des autorités de la Sorbonne (Astronomie-mathématiques, Radioactivité-magnétisme, Zoologie, Géologie). Ces commandes témoignent aussi de ses connaissances et de son goût pour les sciences contemporaines. Proche des Rostand, elle peint leurs portraits et ceux de leurs proches et elle décore leur maison de Cambo-les-Bains.

En 1909, elle reçoit la Légion d’honneur. Une grande exposition personnelle de portraits et de panneaux décoratifs a lieu en 1911 à la galerie Brunner, à Paris. Elle fait un dernier envoi au Salon des artistes français en 1914 et, après la guerre, quelques envois au Salon des Tuileries entre 1926 et 1930. Son travail est alors peu compris par la critique et tombe peu à peu dans l’oubli, même si elle expose régulièrement avec la Société des femmes artistes modernes de 1932 jusqu’à sa mort. Un de ses tableaux est choisi pour la grande exposition Les Femmes artistes d’Europe au Jeu de paume en 1937.
En 1926, elle s’installe à Antibes, manifestement par manque de moyens financiers. Elle meurt dans une extrême pauvreté onze ans plus tard. En 1932 paraît son livre testament, Les Trois Couleurs de la lumière, manifeste ésotérique et féministe, synthèse entre la tradition ésotérique et les recherches scientifiques notamment sur la résonance, les fréquences des couleurs, et insistant sur la place des femmes dans la pensée métaphysique.